基于指纹图谱和4种指标成分的经典名方一贯煎基准样品量值传递分析

　　味中药组成，因其主治肝证有奇效而被收录于《古代经典名方目录（第一批）》。其原方重用君药生地滋阴养血、补益肝肾；当归、枸杞养血滋阴柔肝；北沙参、麦冬滋养肺胃，养阴生津，佐金平木，扶土制木；四药共为臣药，再以川楝子为佐药，疏肝泄热，理气止痛，复其条达之性；诸药合用，共奏疏肝解郁、滋阴养血之功。由于滋阴疏肝系一贯煎传统功效，沿用自古至今，因而一贯煎在临床上多用于治疗肝硬化、肝纤维化、慢性萎缩性胃炎、干燥综合征等消化科、内科疾病，应用广泛且具有显著疗效

　　刘昌孝院士提出了质量标志物（quality markers，Q-Marker）的概念用以作为中药的质控成分，并从质量传递与溯源、成分特有性、成分有效性、复方配伍环境以及成分可测性5个方面对中药Q-Marker的内涵及其发现和确定思路及方法进行了论述[6-8]。课题组前期基于质量传递与溯源原则、成分特有性原则、成分有效性原则、复方配伍环境原则以及成分可测性原则5个方面，从一贯煎中预测分析到17个Q-Marker，其中包括有机酸类成分阿魏酸、苯乙醇苷类成分毛蕊花糖苷、香豆素类成分佛手柑内酯等[9]。

　　目前，一贯煎的相关研究多集中在药理作用、药效机制及临床应用等方面，关于以基准样品量值传递为核心的质量控制方面鲜有文献报道。因而，本实验通过制备15批一贯煎基准样品，建立其HPLC指纹图谱，进行相似度评价及特征峰归属分析，并结合5-羟甲基糠醛、洋川芎内酯I、阿魏酸、毛蕊花糖苷4个指标性成分含量、转移率以及干膏率的传递关系，进行饮片到基准样品的量值传递相关性质量控制研究并深入分析，以期承载经典名方的有效性和安全性，为后续复方制剂的开发奠定实践基础并提供理论支撑。

　　Sartorius BT 25S型十万分之一电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；SK7210LHC型超声清洗仪，上海科导超声仪器有限公司；FTS-10A型陶瓷煎药锅，广东省一壶万里电器实业有限公司；SHB-III型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；H22-X3型九阳电陶炉，杭州九阳生活电器有限公司；FD-2A型真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；Agilent型高效液相色谱仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司，包含二极管阵列检测器（DAD）和Chromeleon 7.2色谱工作站；LC-LX-H185C型台式高速离心机，上海力辰科技有限公司。

　　对照品毛蕊花糖苷（批号21123001）、藁本内酯（批号22031804）、咖啡酸（批号20110501），均购自成都普菲德生物科技有限公司；对照品阿魏酸（批号11）、槲皮素（批号10）、5-羟甲基糠醛（批号11）、东莨菪内酯（批号11），均购自中国食品药品检定研究院；对照品洋川芎内酯I（批号21012505）、绿原酸（批号15060713）、伞形花内酯（批号17042603）均购自上海纯优生物科技有限公司；各对照品质量分数均≥94%。乙腈、甲酸，色谱纯，购自Fisher公司；甲醇，分析纯，购自北京化工厂；怡宝纯净水，购自华润怡宝饮料（中国）有限公司；其他试剂为分析纯。

　　《医方絜度》[10]记载一贯煎处方为“北沙参、麦冬、当归各一钱五分，枸杞、生地各三钱，川楝子二钱。”《古代经典名方关键信息表（7首方剂）》[3]明确处方剂量与制法如下：北沙参、麦冬、当归各5.60 g，生地黄、枸杞子各11.19 g，川楝子7.46 g，水煎服。因《按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则（试行）》[11]明确水煎服应参照《医疗机构中药煎药室管理规范》[12]的相关规定，即药材浸泡30 min以上、加水量应没过药材1.0～1.5 cm为宜，滋补类药材应煎煮40～60 min，并结合具体情况加以优化。

　　本课题组前期以5-羟甲基糠醛、阿魏酸、毛蕊花糖苷和洋川芎内酯I含量和干膏率为参考指标，赋以权重系数对一贯煎基准样品制备工艺进行综合评分，通过料液比、煎煮时间、煎煮次数、提取方式、干燥方式等单因素筛选，最终确定一贯煎基准样品制备方法：处方药材加12倍量，浸泡30 min，煎煮2次，武火加热煮沸后，文火煎煮60 min，采用100目纱布滤过，合并滤液，浓缩至400 mL，即为一贯煎标准煎液；精密移取一贯煎标准煎液5 mL于25 mL西林瓶中，置于−80℃预冷2 h的冷冻干燥机，冻干温度−80℃，线±1）Pa，冷冻干燥24 h，取出压盖密塞，即得一贯煎基准样品（一贯煎冻干粉）。将北沙参、麦冬、当归、生地黄、枸杞子、川楝子各15批饮片采用随机数表法组合，编号为S1～S15，具体组合信息见表2。按上述工艺制备15批一贯煎基准样品以及单味饮片、单味饮片阴性样品。

　　2.2.2供试品溶液的制备精密称定一贯煎基准样品冻干粉约1 g，精密加入10 mL 50%甲醇溶液，超声30 min，于13 000 r/min离心5 min（离心半径6 cm），取上清液过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

　　2.2.3对照品溶液的制备取5-羟甲基糠醛、绿原酸、咖啡酸、伞形花内酯、东莨菪内酯、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I、藁本内酯、槲皮素对照品适量，以50%甲醇溶液制成质量浓度均为40 μg/mL的混合对照品溶液，即得。

　　2.2.4精密度试验取编号为S1的一贯煎基准样品1份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，以6号峰（5-羟甲基糠醛）为参照（参照峰选择依据：以峰形对称，分离度优，无拖尾现象，且峰面积稳定为选择依据，选定5-羟甲基糠醛作为参照峰），计算各共有峰的相对保留时间的RSD均＜0.58%，相对峰面积的RSD均＜0.02%，表明仪器精密度良好。

　　2.2.5重复性试验取编号为S1的一贯煎基准样品1份，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，以6号峰（5-羟甲基糠醛）为参照，计算各共有峰的相对保留时间的RSD均＜0.08%，相对峰面积的RSD均＜0.07%，表明该方法重复性良好。

　　2.2.6稳定性试验取编号为S1的一贯煎基准样品1份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别在制备后0、3、6、9、12、18、24 h进样，以6号峰（5-羟甲基糠醛）为参照，计算各共有峰相对保留时间的RSD均＜0.12%，相对峰面积的RSD均＜0.09%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

　　2.2.7指纹图谱建立及相似度评价按“2.2.2”项下方法制备15批一贯煎基准样品的供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，将15批一贯煎基准样品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版），以S1为参照图谱，采用中位数法，时间窗设为0.1 min，S1～S15的HPLC指纹图谱见图1。15批一贯煎基准样品（S1～S15）指纹图谱相似度分别为0.957、0.826、0.934、0.904、0.866、0.965、0.948、0.922、0.970、0.849、0.862、0.850、0.853、0.910、0.926，结果见表3。除S2、S5、S10～S13，其余批次基准样品相似度均在0.900以上，结果表明药材的产地会直接影响一贯煎基准样品指纹图谱相似度评价，道地产区药材和主产区药材存在一定差异性。

　　根据15批一贯煎基准样品，拟合出对照指纹图谱（R）。从标定了29个共有峰，通过与对照品比对，指认了其中10个共有峰，分别为6号峰5-羟甲基糠醛、16号峰绿原酸、18号峰咖啡酸、20号峰伞形花内酯、21号峰东莨菪内酯、22号峰阿魏酸、23号峰毛蕊花糖苷、24号峰槲皮素、26号峰洋川芎内酯I、28号峰藁本内酯，一贯煎基准样品对照指纹图谱及混合对照品HPLC图谱见图2。

　　饮片-基准样品指纹图谱峰归属关系分析与传递分别取北沙参、麦冬、当归、生地黄、枸杞子和川楝子饮片冻干粉约1 g，按照“2.2.2”方法制备饮片供试品溶液，同法制备各饮片阴性样品供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件进样，建立北沙参、麦冬、当归、生地黄、枸杞子和川楝子单味饮片及单味饮片阴性样品的指纹图谱。通过比对一贯煎基准样品与单味饮片、单味饮片阴性样品的HPLC图谱，发现单味饮片的特征峰均可传递到基准样品的对照图谱中，结果见图3。图谱中14、22（阿魏酸）、25、26（洋川芎内酯I）、27、28号峰（藁本内酯）为当归专属峰，23号峰（毛蕊花糖苷）为生地黄专属峰，9、16（绿原酸）、21号峰为枸杞子专属峰；此外，1号峰归属于北沙参、麦冬、当归、生地黄、枸杞子，2号峰属于北沙参、麦冬、当归、生地黄、枸杞子、川楝子，3号峰归属于北沙参、当归、生地黄、枸杞子，4、13号峰归属于生地黄、枸杞子，5号峰属于北沙参、枸杞子、川楝子，6号峰（5-羟甲基糠醛）属于生地黄、川楝子，7、8、10、17、24号峰属于当归、枸杞子，11、20号峰属于当归、生地黄，12号峰属于当归、枸杞子、川楝子，15号峰属于枸杞子、川楝子，18号峰归属于北沙参、枸杞子，19号峰归属于麦冬、当归、枸杞子、川楝子，29号峰归属于当归、生地黄、枸杞子、川楝子。

　　4、5。饮片-基准样品指纹图谱的传递在特征峰个数与峰面积方面是比较稳定的，标定的各单味药饮片的主要物质群均能完整传递到基准样品，表明一贯煎基准样品制备工艺和供试品溶液制备方法未造成饮片主要物质群丢失。由此可见，大部分一贯煎基准样品特征峰和主要物质群在饮片与基准样品间传递较为稳定，归属关系清晰。

　　2.2.8”项研究结果，选择5-羟甲基糠醛（生地黄、川楝子），洋川芎内酯I和阿魏酸（当归），毛蕊花糖苷（生地黄）为指标性成分，建立了一贯煎基准样品的含量测定方法。

　　2.3.2对照品溶液的制备取5-羟甲基糠醛、洋川芎内酯I、阿魏酸、毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶液制成质量浓度分别为158.4、82.4、142.4、103.2 μg/mL的混合对照品溶液，备用。

　　2.3.3供试品溶液的制备与“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法一致。

　　线性关系考察取不同质量浓度的混合对照品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样，以进样质量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线并计算回归方程，结果分别为5-羟甲基糠醛Y＝74.795 X－81.621，r＝0.999 8，线 μg/mL；洋川芎内酯IY＝41.866 X－69.877，r＝0.999 1，线 μg/mL；阿魏酸Y＝33.342 X＋7.366 1，r＝0.999 2，线 μg/mL；毛蕊花糖苷Y＝3.709 2 X＋68.882，r＝0.999 0，线 μg/mL。2.3.5精密度考察取一贯煎基准样品（S1）供试品溶液1

　　份，按“2.3.1”项下色谱条件，连续进样6次，计算各指标性成分峰面积的RSD值，结果5-羟甲基糠醛、洋川芎内酯I、阿魏酸、毛蕊花糖苷峰面积的RSD分别为0.49%、0.37%、0.37%、0.37%，表明仪器精密度良好。2.3.6重复性考察取一贯煎基准样品（S1），按“2.2.2

　　”项下方法平行制备供试品溶液6份，按“2.3.1”项下色谱条件进样，计算各指标性成分质量分数的RSD值，结果5-羟甲基糠醛、洋川芎内酯I、阿魏酸、毛蕊花糖苷质量分数的RSD分别为0.32%、0.34%、0.34%、0.34%，表明该方法重复性良好。2.3.7稳定性考察取一贯煎基准样品（S1）供试品溶液1

　　份，按“2.3.1”项下色谱条件分别在制备后0、3、6、9、12、18、24 h进样，计算各指标性成分峰面积的RSD值，结果5-羟甲基糠醛、洋川芎内酯I、阿魏酸、毛蕊花糖苷峰面积的RSD分别为0.42%、0.60%、0.44%、0.44%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。2.3.8加样回收率考察精密称定已测知指标性成分含量的一贯煎基准样品适量，共6份，分别加入一定量的对照品溶液，按“2.2.2

　　”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件分别进样，进行含量测定，计算4种指标性成分的加样回收率及RSD值，结果5-羟甲基糠醛、洋川芎内酯I、阿魏酸、毛蕊花糖苷平均加样回收率分别为88.78%、94.86%，94.25%、96.53%，RSD分别为2.02%、1.62%、2.71%、2.94%，表明该方法加样回收率良好。2.3.94种指标性成分含量测定与量值传递分析取15批一贯煎基准样品、当归、生地黄和川楝子单饮片冻干粉，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“

　　2.3.1”项下色谱条件进样，进行指标成分含量测定，计算指标成分从饮片-一贯煎基准样品的转移率，结果见表6。结果表明，15批基准样品（S1～S15）中5-羟甲基糠醛质量分数为90.3

　　144.1 μg/g，洋川芎内酯I质量分数为75.6～166.2 μg/g，阿魏酸质量分数为105.4～200.3 μg/g，毛蕊花糖苷质量分数为149.9～293.3 μg/g；5-羟甲基糠醛、洋川芎内酯I、阿魏酸、毛蕊花糖苷的转移率分别为15.53%～27.11%、38.36%～62.68%、16.23%～31.37%、31.41%～55.65%。结果5-羟甲基糠醛、洋川芎内酯I、阿魏酸、毛蕊花糖苷4个指标成分的含量和转移率大都位于其均值的±30%范围内，说明基准样品的制备工艺相对稳定可行，指标成分可稳定从饮片传递至基准样品中。S1～S15中

　　S5和S15的洋川芎内酯I、S9的阿魏酸和S11的毛蕊花糖苷含量略超出其均值的70%～130%，但也在范围边缘相差并不是很大，其原因可能与药材的产地相关。研究表明，岷当归中苯酞类成分洋川芎内酯I、云当归阿魏酸和怀地黄毛蕊花糖苷含量均高于其他产区[13-17]，S5中当归来自甘肃岷县，S9、S15中当归来自云南丽江，S11中地黄来自陕西咸阳，受产地影响S5和S15中洋川芎内酯I、S9中阿魏酸和S11中毛蕊花糖苷含量略超出均值的±30%。2.4干膏率的测定及传递关系分析

　　取“2.1”项中制备的一贯煎标准煎液和一贯煎各单味饮片标准煎液，精密量取标准煎液25 mL，置于已干燥至恒定质量的蒸发皿中，恒温水浴干燥后，105℃干燥

　　3 h，后置于干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量，计算15批一贯煎基准样品和一贯煎各单味饮片的干膏率。干膏率＝WV/vYW

　　单味饮片干膏率×单味饮片质量/全方饮片总质量）干膏转移率＝干膏率/理论干膏率

　　根据上述公式计算干膏率、理论干膏率和干膏率转移率，结果见表7。结果表明，15批一贯煎干膏率为42.95%

　　～49.93%，平均干膏率为46.03%，理论干膏率为44.67%～55.06%，平均理论干膏率为50.16%，干膏传递率为84.39%～96.15%，平均干膏率传递率为91.84%，各批次一贯煎干膏率、理论干膏率和干膏传递率均位于均值的90%～110%，表明饮片中成分可稳定传递至基准样品。3讨论经典名方基准样品作为后续复方制剂研究及质量控制的参照，其指标性成分的选择在基准样品质量控制中具有重要意义。一贯煎处方中生地黄为君药，能够滋阴养血、补益肝肾；当归、枸杞、北沙参、麦冬四药共为臣药，具有养血滋阴柔肝、滋养肺胃、养阴生津的功效；川楝子为佐药，疏肝泄热，理气止痛。诸药合用，共奏疏肝解郁、滋阴养血之功。现代药理学研究表明，当归中阿魏酸、洋川芎内酯I均能够抑制促炎细胞因子的分泌，激活抗氧化反应元件调控基因的转录，改善肝脏病理状态，从而起到保护肝脏的作用[18-20]。生地黄和川楝子共有的

　　interleukin-1β，IL-1β）的产生，避免或缓解肝氧化损伤，从而起到一定的肝脏保护作用[21]。研究还发现，生地黄中毛蕊花糖苷能够保护肝损伤，降低丙氨酸氨基转移酶、谷氨酸氨基转移酶的活性和肝指数[22-23]。因此，基于指标成分与药效关联性分析，故选择5-羟甲基糠醛、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I作为含量测定中一贯煎的指标性成分。本实验以指纹图谱、指标成分和干膏率的传递为核心，探讨饮片-一贯煎基准样品的关键质量属性的传递规律。结果表明，15批一贯煎基准样品归属了29个共有峰，确定了其中10个成分并明确药材归属，分别为6号峰5-

　　羟甲基糠醛、16号峰绿原酸、18号峰咖啡酸、20号峰伞形花内酯、21号峰东莨菪内酯、22号峰阿魏酸、23号峰毛蕊花糖苷、24号峰槲皮素、26号峰洋川芎内酯I和28号峰藁本内酯。但《中国药典》2020年版上记载的药材质控成分并未被囊括于29个特征峰中，其原因为麦冬中鲁斯可皂苷元不具备HPLC-UV检测的结构特点，地黄中梓醇和地黄苷D、枸杞子中甜菜碱以及川楝子中川楝素在低波段方才能被检出，而低波段存在倒峰、末端吸收、基线漂移和氨基酸、多糖超高吸收等干扰。而当归中洋川芎内酯I、地黄与川楝子共有的

　　5-羟甲基糠醛在280 nm下吸收较大且峰形和分离度良好，当归中阿魏酸、藁本内酯和地黄毛蕊花糖苷在321 nm下吸收较高且峰形与分离度均能满足检测要求。另外，定性的绿原酸、咖啡酸、伞形花内酯、东莨菪内酯和槲皮素也可在280、321 nm下顺利检出，因此，指纹图谱和成分含量测定检测波长选定为280、321 nm。对于上述不足之处，本课题组今后将进一步深入研究，结合HPLC-ELSD方法对一贯煎非

　　UV成分（甾体皂苷类和氨基酸类成分）展开指纹图谱研究和含量测定方，应用LC-MS（低波段下吸收较大的成分）进行全面质量控制，力求一贯煎质控指标包含《中国药典》2020年版[24]单味药项下规定的指标性成分，为一贯煎基准样品质量评价提供更加全面的理论依据。以5-羟甲基糠醛、洋川芎内酯I、阿魏酸和毛蕊花糖苷含量为参考指标，通过比较不同提取溶剂及剂量、不同提取方式、不同提取时间，最终筛选得到一贯煎基准样品供试品溶液制备方法：精密称定一贯煎基准样品适量，以50%甲醇超声提取，离心，即得。S5和S15的洋川芎内酯I

　　、S9的阿魏酸和S11的毛蕊花糖苷含量略超出均值的70%～130%，但也在范围边缘相差并不是很大，推测缘由可能与药材的产地相关。经研究发现，岷当归洋川芎内酯I[13]、云当归阿魏酸[14]均为成分识别标志，不同产区中岷当归苯酞类成分含量最高[15]，云当归阿魏酸含量最高[16]，S5中当归来自甘肃岷县，S9、S15中当归来自云南丽江，受产地影响S5中洋川芎内酯I和S9中阿魏酸含量略超出均值的130%，S15中洋川芎内酯I含量略低于均值的70%。研究表明，不同产区中河南产地黄中毛蕊花糖苷的含量普遍较高[17]，而河南为地黄道地产区，S11中地黄来自陕西咸阳，并非道地产区药材，受产地影响S11中地黄的毛蕊花糖苷含量略低于均值的70%。因此，在制备一贯煎基准样品期间，需考虑药材产地以保证基准样品质量稳定性，并动态监控成分含量。4结论一贯煎依托“理、法、方、药”，组方严谨、用药精炼，具有滋阴疏肝之功效，主治肝肾阴虚证。为保证经典名方质量疗效一致，需以基准样品为核心，建立从饮片到中间体的质量控制体系，而基准样品质量稳定的前提是处方所用饮片的质量需均一、稳定[25]。本实验采用指纹图谱、指标性成分含量测定及干膏率相结合的模式，对经典名方一贯煎基准样品的量值传递过程进行研究分析，初步建立了科学稳定的基准样品质量评价方法，以期为经典名方一贯煎的后续开发及相关制剂的质量控制提供依据。利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

　　参考文献（略）来 源：胡钰荧，李淑萍，热依木古丽·阿布都拉，阿吉艾克拜尔·艾萨，吴 涛．基于指纹图谱和4种指标成分的经典名方一贯煎基准样品量值传递分析 [J]. 中草药, 2023, 54(18):5880-5891.BOB·体育综合APP下载